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发布者:真人斗牛app    发布时间:2022-05-24     
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一(yi)(yi)般(ban)来说,利用质谱数据(ju)鉴定蛋(dan)白(bai)(bai)质主要有两种方法(fa)(fa):肽(tai)(tai)(tai)质量(liang)指纹图谱(PMF)和肽(tai)(tai)(tai)序(xu)(xu)列标签(qian)分析(xi)(sequence tag analysis)。这两种方法(fa)(fa)较传统的(de)(de)(de)(de) N 端测序(xu)(xu)或(huo)内(nei)部(bu) Edman 测序(xu)(xu)法(fa)(fa)敏感数百倍,其检测低限为(wei)飞摩尔(fmol)水平(如银染的(de)(de)(de)(de) 2D胶(jiao)点或(huo) 1D 胶(jiao)带(dai))。然而,足够多的(de)(de)(de)(de)样(yang)(yang)品(pin)蛋(dan)白(bai)(bai)量(liang)可(ke)以增加识别的(de)(de)(de)(de)成功率,这是(shi)因为(wei)增大样(yang)(yang)品(pin)蛋(dan)白(bai)(bai)量(liang)可(ke)以克(ke)服一(yi)(yi)些污染物的(de)(de)(de)(de)干扰(如角(jiao)蛋(dan)白(bai)(bai),在(zai)样(yang)(yang)品(pin)中的(de)(de)(de)(de)存在(zai)非常常见)。数据(ju)库(ku)的(de)(de)(de)(de)检索是(shi)利用计(ji)算机程序(xu)(xu)算法(fa)(fa)将实验测得的(de)(de)(de)(de)肽(tai)(tai)(tai)质量(liang)数据(ju)与蛋(dan)白(bai)(bai)质序(xu)(xu)列数据(ju)库(ku)中的(de)(de)(de)(de)蛋(dan)白(bai)(bai)质的(de)(de)(de)(de)肽(tai)(tai)(tai)质量(liang)计(ji)算值进行(xing)相关(guan)性比较分析(xi),从而得出可(ke)能蛋(dan)白(bai)(bai)质的(de)(de)(de)(de)概率并(bing)将相关(guan)性最好(hao)的(de)(de)(de)(de)结果(guo)排序(xu)(xu),这是(shi)凝胶(jiao)分离蛋(dan)白(bai)(bai)质鉴定的(de)(de)(de)(de)最常用手(shou)段(duan)。


这(zhei)(zhei)种检(jian)索(suo)途径有一个(ge)明显的(de)(de)限制(zhi),就是被鉴定的(de)(de)蛋(dan)(dan)白质(zhi)(zhi)必(bi)须在序(xu)列(lie)数据(ju)(ju)(ju)库(ku)(蛋(dan)(dan)白质(zhi)(zhi)数据(ju)(ju)(ju)库(ku)和核酸序(xu)列(lie)翻译数据(ju)(ju)(ju)库(ku))中(zhong)存在。PMF 检(jian)索(suo)鉴定蛋(dan)(dan)白质(zhi)(zhi)是依据(ju)(ju)(ju)实(shi)验中(zhong)获得(de)的(de)(de)蛋(dan)(dan)白质(zhi)(zhi)的(de)(de)多个(ge)肽(tai)段质(zhi)(zhi)量数据(ju)(ju)(ju)与同一蛋(dan)(dan)白质(zhi)(zhi)肽(tai)段质(zhi)(zhi)量理(li)论计算值的(de)(de)之间的(de)(de)相关性比较。因此,这(zhei)(zhei)一技术不适用(yong)(yong)于检(jian)索(suo) EST 翻译序(xu)列(lie),也(ye)不适用(yong)(yong)于鉴定蛋(dan)(dan)白质(zhi)(zhi)的(de)(de)混(hun)合物。而肽(tai)序(xu)列(lie)标签分析(sequence tag analysis)可(ke)适用(yong)(yong)于检(jian)索(suo)EST 数据(ju)(ju)(ju)库(ku)。对(dui)PMF 数据(ju)(ju)(ju),主要搜索(suo)Swiss Prot (速度快(kuai)但不全面)和NCBI (速度虽慢(man)但包(bao)含更多的(de)(de)信息)数据(ju)(ju)(ju)库(ku)。如果(guo)你认为你的(de)(de)蛋(dan)(dan)白质(zhi)(zhi)可(ke)能为新的(de)(de)蛋(dan)(dan)白质(zhi)(zhi),选择(ze)NCBI数据(ju)(ju)(ju)库(ku),标准搜索(suo)选择(ze)Swiss Prot 数据(ju)(ju)(ju)为好。如果(guo)需要,也(ye)可(ke)搜索(suo)EST数据(ju)(ju)(ju)库(ku)(用(yong)(yong)MS/MS数据(ju)(ju)(ju)按(an)搜索(suo)更有效(xiao))。


检索条件的设置与结果(guo)判断(duan):


1.肽(tai)片段(duan)质量选择在 800-4000Da 范围。


2.氨基(ji) 酸(suan) 残 基(ji) 的(de) 修 饰 ( Modifications ):半 胱 氨 酸(suan) 为(wei) 脲 甲 基(ji) 半 胱 氨 酸(suan)(Cardamidomethyl-Cys),蛋氨酸(suan)选择(ze)可(ke)变修饰—氧化。


3. 最(zui)大(da)允许的(de)肽质(zhi)(zhi)量误差(cha)( Mass Tolerances),与仪(yi)器性能和数据质(zhi)(zhi)量有(you)关,一般(ban)设为±0.1Da,最(zui)大(da)为±0.5Da,质(zhi)(zhi)量误差(cha)愈小,搜索的(de)特异性愈高。


4. 不完(wan)全酶解(jie)位点数目(mu)(Missed cleavages):每个(ge)肽允许(xu)有 2 个(ge)不完(wan)全裂解(jie)位点,一般选(xuan) 1(如果蛋白充分变性(xing)且(qie)酶解(jie)完(wan)全)。


5. 参(can)(can)考蛋白(bai)质(zhi)表观(guan)分子(zi)量和等(deng)电点,表观(guan) PI 误(wu)差范(fan)围为(wei)(wei)±0.5pH,表观(guan) Mr 误(wu)差为(wei)(wei)范(fan)围为(wei)(wei)±20%。一(yi)般情况下不选此项,在判(pan)读(du)结果时参(can)(can)考。


6. 物种(zhong)(zhong)选择(ze):限(xian)定物种(zhong)(zhong)。


7. 离子选择(ze):[M+H]+,单同(tong)位(wei)素


8. 最少(shao)匹配肽片段(duan)规定为(wei) 4。

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